ER/PR免疫組化檢測(cè)試劑盒    H   做線粒體膜UCP2蛋白的Western Blot （以下簡(jiǎn)寫成Western Blot），提取線粒體后凍存（未加蛋白酶抑制劑），樣品不能反復(fù)凍融;，加蛋白酶抑制劑。同時(shí)，建議檢查Western Blot過(guò)程， 提高一抗?jié)舛?。?duì)于加蛋白酶抑制劑來(lái)說(shuō)，一般加PMSF就可以了，能多加幾中種蛋白酶抑制劑。
同一蛋白樣品能同時(shí)進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測(cè)，有的甚至可以同時(shí)測(cè)幾十種樣品。
如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑就要溫和得多，這時(shí)加上NaF去抑制磷#化酶的活性。
樣品的蛋白含量很低，每微升不到微克，但是在轉(zhuǎn)膜時(shí)經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，可以加大上樣量，轉(zhuǎn)移時(shí)可以用減少電流延長(zhǎng)時(shí)間，多加5-0%甲醇。
ER/PR免疫組化檢測(cè)試劑盒    H 想分離的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE電泳的分離膠濃度用6%，Stacking Gel 3.5%，但260kd的蛋白不好做
如果上樣量超載，可以濃縮樣品，也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超載30%是不會(huì)有問(wèn)題的。如果已經(jīng)超了不少了，而且小分子量的也要，可以考慮加大膠的厚度，可以試試.5mm的 comb。
蛋白變性后存放-80℃，一兩年沒(méi)有問(wèn)題，zui關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉;不要被細(xì)菌消化掉（也是被酶水解了）。
ER/PR免疫組化檢測(cè)試劑盒    H 采用DAB顯色技術(shù)，二抗是化的多克隆抗體，三抗是親和素體系，不能使用脫脂奶粉，脫脂奶粉會(huì)影響親和素的生成，因?yàn)槊撝谭壑泻?，用BSA代替應(yīng)該好一點(diǎn).
Western Blot一般上樣30-00微克不等，結(jié)果跟目的蛋白的豐度、上樣量、一二抗的量和撫育時(shí)間都有關(guān)系，也與顯色時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。開始摸條件時(shí)，為了拿到陽(yáng)性結(jié)果，各個(gè)步驟都可以量多一點(diǎn)時(shí)間長(zhǎng)一點(diǎn)，當(dāng)然背景也就出來(lái)了。要拿到好的結(jié)果，如果抗體好的話比較容易，抗體不好的話就需要反復(fù)地試了，當(dāng)然有的不適合Western Blot的怎樣做也不行。所以拿到好的結(jié)果不容易。