Western Blot之膜的選擇

【資料簡介】

Western Blot印跡常用的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和PVDF膜，此外也有用尼龍膜、DEAE纖維素膜做蛋白印跡。

選擇的根據(jù)主要有：

a. 膜與目的蛋白分子的結(jié)合能力（也就是單位面積的膜能結(jié)合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大小）；

b. 不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適和用于所選的顯色方法，信噪比好）；

c. 如果后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質(zhì)譜分析，還要根據(jù)不同目的來挑選不同的轉(zhuǎn)移膜。

列表形式對主要的三種膜進行比較。

	NC膜	尼龍膜	PVDF膜
靈敏度和分辨率	高	高	高
背景	低	較高	低
結(jié)合能力	80－110 ug/cm2	>400 ug/cm2	125－200 ug/cm2（適合于SDS存在下與蛋白質(zhì)的結(jié)合）
材料質(zhì)地	干的NC膜易脆	軟而結(jié)實	機械強度高
溶劑耐受性	無	無	有
操作程序	緩沖液潤濕,避免氣泡	緩沖液潤濕	使用*%甲醇潤濕
檢測方式	常規(guī)染色，可用放射性和非放射性檢測	不能用陰離子染料	常規(guī)染色， 比較于NC膜，可用考馬斯亮藍染色，可用于ECL檢測，質(zhì)譜分析和快速免疫檢測。
適用范圍	0.45um 一般蛋白	0.2um一分子量小于20kD蛋白	0.1um一分子量小于7kD蛋白  低濃度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖（主要用在核酸檢測中）   糖蛋白檢測和蛋白質(zhì)測序。
價格	價格較便宜	便宜	較貴

 

硝酸纖維素膜

硝酸纖維素膜是蛋白印跡zui廣泛使用的轉(zhuǎn)移介質(zhì)，對蛋白有很強的結(jié)合能力，而且適用于各種顯色方法，包括同位素，化學(xué)發(fā)光（Luminol類）、常規(guī)顯色、染色和熒光顯色；背景低，信噪比高。NC膜的使用也很簡便，不需要甲醛預(yù)處理，只要在無離子水面浸潤排出膜內(nèi)氣泡，再在電泳緩沖液中平衡幾分鐘就可以了；NC膜很容易封閉，也不需要特別嚴謹?shù)那逑礂l件。轉(zhuǎn)移到NC膜上的蛋白在合適的條件下可以穩(wěn)定保存很長時間，不過要注意的是純的硝纖膜在比較脆，又容易卷，操作要小心，不適合用于需要多次重復(fù)清洗的用途——因為經(jīng)不起多次“折磨”。選擇硝纖膜時要注意的是選擇合適的孔徑，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔徑的膜，小于20KD的話建議選擇0.2um的，如果小于7KD的話選擇0.1um的膜。另外還要注意選擇純的NC膜——混有含醋酸纖維（CM）的NC膜結(jié)合力會有所降低。另外提醒一句：由于NC膜上結(jié)合的蛋白會因為一些去污劑而被代替，因此在封閉時使用較溫和的Tween20，而且濃度不要超過0.3%（據(jù)說0.05%效果）。一般而言，NC膜越純，其蛋白結(jié)合能力就越高，所以要增加WB的靈敏度和分辨率，提高所使用膜的純度是個可以考慮的選擇。如果NC膜攙雜一些醋化纖維素——這在前面已經(jīng)提到，會影響蛋白質(zhì)結(jié)合。Protran由于是純NC膜，比較脆，機械耐受力欠佳，需要小心操作，如果擔(dān)心自己“粗手粗腳”，那么就可以考慮一下Optitran或者Pall公司的以耐受力著稱的BioTrace NT Nitrocellulose Transfer Membrane。卷膜肯定是*的選擇，只不過要自己動手裁剪——切記，必須帶手套操作。

PVDF膜

與硝酸纖維素膜相比，PVDF膜在蛋白質(zhì)截留能力，機械強度和化學(xué)相容性上都更*的性能。市售硝酸纖維素膜的典型結(jié)合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜結(jié)合量是100-200μg/cm2（而結(jié)合強度PVDF比硝纖膜強6倍！）。但是PVDF膜zui大的優(yōu)點不僅于此：更好的機械強度和化學(xué)耐受性使PVDF膜在各種染色應(yīng)用和多重免疫檢測中成為理想選擇；而且單個凝膠的泳道復(fù)本可用于多種目的，特別是需要做N端蛋白測序，在相當(dāng)“嚴酷”的清洗條件下，當(dāng)尼龍或者硝纖膜已經(jīng)降解的情況下PVDF膜依然保持本色，笑傲江湖。所以PVDF也是要做蛋白測序的*選擇。但不適合熒光。PVDF膜特別注意的是需要100%甲醇預(yù)處理（不超過15秒）再用緩沖液平衡，才能用，而且適用過程中萬一干了也要同樣程序再處理（不過要真出現(xiàn)這種問題也是自己欠扁，誰要你不小心呢，轉(zhuǎn)膜前處理也就罷了，轉(zhuǎn)膜后再這樣處理可能會影響后繼的抗體識別呢）。PVDF膜同樣分0.45um和0.2um的，后者孔徑小，對小分子蛋白有較好的攔截吸附，背景可能會比前者稍高。

卷膜經(jīng)濟實惠，裁剪剩下的邊角料還可以用來做點雜交。再次強調(diào)的是，疏水PVDF膜在用前必須經(jīng)過50%或以上體積比的甲醇或者乙醇溶液處理幾分鐘，待膜變成半透明后用純水漂洗一下，轉(zhuǎn)入電泳緩沖液平衡才能用。