Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒實驗原理

【資料簡介】

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒AlamaBlue 細胞活力檢測試劑盒提供了一種可靠、靈敏、安全和低成本的快速有效檢測細胞活力與毒性的方法。AlamaBlue 通過在細胞生長的培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的化學還原反應，將非熒光信號的染料轉(zhuǎn)換成為一紅色熒光物質(zhì)，試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），從而檢測細胞的存活率。維持細胞需要還原性環(huán)境而抑制生長則表現(xiàn)為氧化型環(huán)境。細胞生長率相關(guān)的降低可表現(xiàn)為氧化還原指示劑從氧化型（非熒光素、紫色）轉(zhuǎn)為還原型（熒光素、紅色）。該熒光信號可以用530~560nm 的激發(fā)波激發(fā)，在590nm 處可以獲發(fā)射波，檢測570 和600nm 的的吸光度值，校正監(jiān)測值，可以減去相應的570nm 和600nm 的背景吸光度值。檢測所產(chǎn)生的熒光信號是與樣品中的活細胞數(shù)成正比的。

AlamaBlue 細胞活性檢測試劑盒的靈敏度相似于[3H]胸苷法檢測細胞增殖法。根據(jù)不同類型的細胞，AlamaBlue 可以檢測到至少40個細胞，同時保證很好的重現(xiàn)性和靈敏度。作為試鹵靈（紫紅、紅色熒光）可以進一步被還原為水解化的試鹵靈（無色、無熒光），當細胞數(shù)量增多，所有的刃天青（7-羥基-3-羰基-10-氧化-三氫吩惡嗪）被轉(zhuǎn)換為試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），試劑盒的信號反而會發(fā)生衰減。因此，對于您所用的試劑盒來說，針對不同的細胞類型，應該調(diào)整您的細胞數(shù)，做相應的優(yōu)化，才能得到更好的結(jié)果。

操作說明

以下操作可用作通用指導建議?？紤]不同細胞類型與培養(yǎng)條件的差異性，有必要根據(jù)實際情況優(yōu)化您的操作步驟。

1. 96 孔細胞培養(yǎng)板每孔100μL 培養(yǎng)基飼養(yǎng)細胞，控制細胞數(shù)目在40~10000 個/貼壁細胞，2000~500000 個/懸浮細胞。設(shè)置空培養(yǎng)基做對照。

2. 加入10μL AlamaBlue 溶液至培養(yǎng)基中，37 度孵育：24 小時（比色法讀數(shù)）；5-6 小時（熒光讀數(shù)）。

3. 檢測570nm 和600nm 的吸光度，或者用熒光微孔板讀數(shù)530nm 激發(fā)，590nm 發(fā)射波讀數(shù)。

4. 如果采用比色法檢測，選擇OD570-OD600 檢測，如果檢測熒光信號，請在校正OD 值后，先設(shè)置標準曲線，選擇合適您實驗的細胞最佳濃度。

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒注意事項：

1、懸浮細胞用此法時必須經(jīng)離心后才能吸出上清再加DMSO。

2、Formazan 的生成不僅與活細胞數(shù)成比例，也受作用時間的影響，因此當樣品較多時測定的OD 值可能隨時間而變。

3、MTT 溶液為黃色，需避光保存，長時間光照會導致失效。當顏色變?yōu)榛揖G色時，請勿使用。MTT 溶液在4℃或較低溫度情況下會凝固，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作規(guī)程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數(shù)目，需根據(jù)細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養(yǎng)箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結(jié)果分析

 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養(yǎng)基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

試劑盒使用注意說明：

1.由于現(xiàn)有條件及科學技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風險。

2.最終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準備充足的標本備份。

3.不同批次的同一產(chǎn)品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進行實驗操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。

4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他商的產(chǎn)品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結(jié)果。

5.本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

6.使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質(zhì)的引入導致ELISA實驗結(jié)果偏差。

7.若樣本為細胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態(tài)、細胞數(shù)量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

8.某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。