血基因組DNA大量試劑盒提取法

【資料簡(jiǎn)介】

實(shí)驗(yàn)方法原理    本試劑盒采用*的兩相分離技術(shù)，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到純化基因組DN的目的。適合從5 ml的抗凝人或哺乳動(dòng)物全血，或500 μl 抗凝鳥(niǎo)類或兩棲動(dòng)物全血中獲得多至250 μg 的基因組DNA。
實(shí)驗(yàn)材料    抗凝全血
試劑、試劑盒    血基因組DNA大量試劑盒
儀器、耗材    DNA 制備管中量濾器連接管
實(shí)驗(yàn)步驟    
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性 
 
1.  說(shuō)明書，耗材：DNA 制備管、中量濾器、連接管。
 
2.  Buffer VL：細(xì)胞和病毒裂解液，室溫密閉貯存。
 
3.  Buffer G-B：蛋白沉淀液，室溫密閉貯存。
 
4.  Buffer DV-A：Buffer DV 的制備液。請(qǐng)參照實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備Buffer DV 的配制方法配制，室溫密閉貯存。
 
5.  Buffer DV：相分離液，室溫密閉貯存。
 
6.  Buffer BV：DNA 結(jié)合液，室溫密閉貯存。
 
7.  Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
 
8.  Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存?？捎?乙醇或95%乙醇。
 
9.  Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。
 
二、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 
 
1.  *次使用時(shí)，在Buffer W2 concentrate 中按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。
 
2.  準(zhǔn)備無(wú)核酸和核酸酶污染的Tip 頭、離心管。
 
3.  制備Buffer DV：取4 ml Buffer DV-A 250 ml 異丙醇，150 ml 異丁醇，加入提供的500 ml 試劑瓶中，混合均勻。
 
4.  4℃預(yù)冷Buffer DV。
 
三、實(shí)驗(yàn)步驟 

【DNA 釋放 】
 
1. 將5 ml 抗凝全血置于一50 ml 離心管中，若全血樣本體積不足5 ml，用PBS 補(bǔ)充至5 ml。
 
2. 加入10 ml Buffer VL，蓋緊離心管帽，旋渦振蕩1 min。
 
3. 加入10 ml Buffer G-B，再次蓋緊離心管帽，立刻上下混勻。
 
【兩相分離去除蛋白和其它雜質(zhì)】
 
4. 加入20 ml Buffer DV（4℃預(yù)冷），用力混合均勻?！? 000×g 離心5 min。
 
* 請(qǐng)?jiān)趯?shí)驗(yàn)前按照*頁(yè)準(zhǔn)備Buffer DV。
 
5. 盡可能丟棄上相，保留相間沉淀和下相。加入20 ml 4℃預(yù)冷Buffer DV，用力混合，≥5 000×g離心5 min。
 
【基因組DNA 的純化】
 
6. 丟棄上相，將下相轉(zhuǎn)移至中量濾器中（濾器置于另一50 ml 離心管中），將活塞插入注射器，緩慢推動(dòng)活塞，收集50 ml 離心管中的濾液。
 
* 上相必須*棄盡。
 
7. 棄濾器，在濾液中加入10 ml Buffer BV，混合均勻。
 
8. 將DNA 大量制備管插到負(fù)壓裝置的插口上，將步驟7 的混合液移到制備管中，開(kāi)啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓裝置至-20-30 英寸汞柱。
 
9. 待步驟8 管中液體都吸盡后，加入15 ml Buffer W1，吸盡管中液體，保持負(fù)壓。
 
10. 加入20 ml 已加入乙醇的Buffer W2，吸盡管中液體，關(guān)閉負(fù)壓裝置。
 
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的體積加入無(wú)水乙醇。
 
11. 將大量制備管從負(fù)壓裝置轉(zhuǎn)移至另一潔凈的50 ml 離心管中，≥6 000×g 離心5 min。
 
12. 將大量制備管插回到負(fù)壓裝置的插口上，保持負(fù)壓5 min，吸盡殘存的Buffer W2。
 
13. 將大量制備管置于另一潔凈的50 ml 離心管中，在silica 膜*加1.5 ml Eluent 或去離子水，室溫靜置5 min，≥6 000×g 離心5 min 洗脫DNA。
 
* 將去離子水或Eluent 加熱至65℃將提高洗脫效率。
 
14. 可選步驟：同樣方法，在silica 膜*加0.75 ml Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min，≥6 000×g 離心5 min 洗脫DNA。
收起 
注意事項(xiàng)    
1.  下列操作步驟適合從5 ml 的抗凝人或哺乳動(dòng)物全血，或500 μl 抗凝鳥(niǎo)類或兩棲動(dòng)物全血中獲得多至250 μg 的基因組DNA。
 
2.  Buffer VL，Buffer BV 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水和生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢。
 
3.  在按照此說(shuō)明書操作前，請(qǐng)確保已做好足夠的對(duì)血傳播病毒的防護(hù)工作，按照正確方法處理體液和感染體。
 
4.  操作時(shí)嚴(yán)格按操作步驟進(jìn)行，廢物必須放入含消毒液的廢物缸，并高壓滅菌。