分析基因表達(dá)，我們有很多選擇：qPCR、芯片和RNA-Seq。然而，大多數(shù)表達(dá)分析往往只關(guān)注一個(gè)參數(shù)：轉(zhuǎn)錄本豐度。它們既不能提供空間信息，即特定RNA位于何處；也不能確定細(xì)胞之間表達(dá)水平的差異，因?yàn)榧?xì)胞群體的研究讓這一信息丟失。

原位雜交（ISH）這種顯微鏡方法解決了這兩個(gè)問題。它利用標(biāo)記的核酸探針來確定組織及細(xì)胞中DNA或RNA的空間位置和豐度。這種方法有兩種形式，熒光（FISH）和顯色（CISH）。之前，F(xiàn)ISH和CISH一直是定性的：要么陽性，要么陰性。隨著技術(shù)的發(fā)展，定量版本也被開發(fā)出來。

單分子熒光原位雜交（smFISH）是一種新的基因表達(dá)分析方法，能報(bào)告轉(zhuǎn)錄本豐度和空間定位。但到目前為止，smFISH還不能實(shí)現(xiàn)基因組范圍的分析。如今，瑞士蘇黎世大學(xué)的研究人員報(bào)告了一種策略，讓smFISH也插上高通量的翅膀。1

蘇黎世大學(xué)分子生命科學(xué)研究所的Lucas Pelkmans領(lǐng)導(dǎo)了這項(xiàng)研究。他解釋道，傳統(tǒng)的smFISH有兩個(gè)主要缺點(diǎn)，阻礙了它的高通量應(yīng)用。首先，它產(chǎn)生相對(duì)較弱的信號(hào)，信噪比不太高。其次，它不能擴(kuò)展，因?yàn)樗枰叩姆糯蟊稊?shù)，長(zhǎng)的成像時(shí)間，并且每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的條件需要優(yōu)化。

傳統(tǒng)的smFISH利用一系列短的寡核苷酸來檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)寡核苷酸上標(biāo)記有一個(gè)熒光基團(tuán)。這樣，mRNA上就有足夠濃度的熒光分子，產(chǎn)生可見的光點(diǎn)，但通常只有在60x或100x放大倍數(shù)下，使用油浸、大數(shù)值孔徑的透鏡才行。

Pelkmans及其團(tuán)隊(duì)以支鏈DNA（branched DNA）為基礎(chǔ)開發(fā)了他們的方法。在這一策略中，15對(duì)寡核苷酸探針靶定一個(gè)特定的mRNA。這些探針將作為一級(jí)preamplifier探針的著陸墊，又為一些二級(jí)的amplifier探針提供了結(jié)合位點(diǎn)，zui后是一組三級(jí)的標(biāo)記探針。

Pelkmans解釋道，這就像在轉(zhuǎn)錄本上種下了15顆雜交探針的樹。這種方法產(chǎn)生了放大的信號(hào)，亮度增加100倍，信噪比也提高3倍，而成像時(shí)間比傳統(tǒng)方法大大縮短。

憑借這種強(qiáng)烈的信號(hào)，研究小組將實(shí)驗(yàn)過程自動(dòng)化。他們建立了928個(gè)人類基因的支鏈DNA庫，并用培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞進(jìn)行了檢驗(yàn)。在這一過程中，他們使用384孔板，每孔用一個(gè)探針，并使用相同的雜交和洗滌條件。雜交之后，他們以40x放大倍數(shù)對(duì)每孔中約1萬個(gè)細(xì)胞進(jìn)行成像，并利用內(nèi)部開發(fā)的算法來提取轉(zhuǎn)錄本豐度和空間特征，例如，斑點(diǎn)靠近細(xì)胞膜，還是細(xì)胞核，集中還是分散。他們總共收集了18個(gè)空間變量，并利用計(jì)算機(jī)集群來評(píng)估它們與基因調(diào)控的關(guān)系。

數(shù)據(jù)表明，那些表現(xiàn)出相似的空間特征和相似的細(xì)胞間差異的基因，也更有可能具有相似的功能作用。

“事實(shí)證明，那些空間特征實(shí)際上提供了更多信息，可預(yù)測(cè)基因之間的功能性相互作用，”Pelkmans解釋道。

大家都認(rèn)為，單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄充滿噪音。也就是說，細(xì)胞質(zhì)中兩個(gè)遺傳上*相同的細(xì)胞可能有著*不同的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。然而，蛋白水平不一定反映這種轉(zhuǎn)錄本豐度。Pelkmans認(rèn)為，生物過程的可靠性有可能源于mRNA亞細(xì)胞定位的調(diào)節(jié)，而他們的數(shù)據(jù)也支持這一觀點(diǎn)。如今，他們的目標(biāo)是直接檢驗(yàn)這一假說，以確定“轉(zhuǎn)錄本的空間結(jié)構(gòu)是否緩沖了轉(zhuǎn)錄噪音”。

霍華德•休斯醫(yī)學(xué)研究所的項(xiàng)目科學(xué)家Timothee Lionnet認(rèn)為這項(xiàng)研究是“自動(dòng)化的力作”。他談道：“他們將FISH技術(shù)帶到了多重PCR或RNA-Seq技術(shù)所達(dá)到的通量。”

據(jù)Lionnet介紹，這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)明顯延伸是多重檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本。兩家推出支鏈DNA技術(shù)的公司，Affymetrix和Advanced Cell Diagnostics，目前已經(jīng)提供多重的FISH探針。據(jù)Life Technologies介紹，它將在11月開始銷售ACD的smFISH試劑。

之前，加州理工學(xué)院的化學(xué)家蔡龍（Long Cai）也介紹了一種超分辨率條形碼技術(shù)，能檢測(cè)每個(gè)細(xì)胞中32個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本2。他們利用smFISH技術(shù)將單個(gè)mRNA與包含*熒光基團(tuán)組合的寡核苷酸探針進(jìn)行了雜交，隨后利用超分辨率顯微鏡計(jì)數(shù)了這些熒光條形碼mRNA。

Pelkmans的團(tuán)隊(duì)觀察到總體上與RNA-Seq的數(shù)據(jù)有著良好的一致性，但每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量沒那么高。他們稱之為“天花板效應(yīng)”。此外，這種技術(shù)還不能有效檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄本，不過研究人員在固定液中加入乙酸，能減輕這種影響。