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上海博湖生物科技有限公司
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免疫熒光實(shí)驗(yàn)背景染色較深的原因
2022-6-10 閱讀(5029)
背景染色較深的原因有哪些?
1、抗體濃度過高一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說明書進(jìn)行染色。
2、抗體孵音時(shí)間過長(zhǎng)或溫度較高解決辦法是嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程更好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘及時(shí)提醒避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法(Polymer)敏感性很高要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)而是30分鐘因此要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
3、DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)DAB更好現(xiàn)用現(xiàn)配如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)因?yàn)樵跊]有酶的情況下過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色更好在顯微鏡下監(jiān)控達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控避免顯色時(shí)間過長(zhǎng)。
4、組織變干修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。解決的辦法是操作要認(rèn)真仔細(xì)采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈可以有效的避免液體流失也能提高操作速度。
5、切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)(大于24小時(shí))原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前將切片脫蠟至修復(fù)第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在40C冰箱過夜對(duì)結(jié)果無明顯影響如果放在室溫特別是炎熱的夏天會(huì)出現(xiàn)背景著色因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。
6、一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克降抗體注意抗體的有效期過期的抗體要么不昂色要么背暑著色，用新買抗體時(shí)更好設(shè)立陽性對(duì)照和用使用過的抗體作比較
