基于它們的陽離子依賴性和作用的zui適pH，已鑒定出五種鞘磷脂酶（SMase）。它們是溶酶體酸SMase，分泌的鋅依賴性酸SMase，鎂依賴性中性SMase，鎂依賴性中性SMase和堿性SMase。在這五種類型中，溶酶體酸性SMase和依賴鎂的中性SMase被認(rèn)為是在細(xì)胞對應(yīng)激反應(yīng)中產(chǎn)生神經(jīng)酰胺的主要候選藥物。我們的Amplite™熒光鞘磷脂酶測定試劑盒提供了檢測中性SMase活性或篩選其抑制劑的zui靈敏方法。該試劑盒使用Amplite™Red作為熒光探針來間接定量鞘磷脂酶（SMase）水解鞘磷脂（SM）產(chǎn)生的磷酸danjian。它可以用于測量血液中的SMase活性，細(xì)胞提取物或其他溶液。Amplite™Red的熒光強(qiáng)度與磷酸danjian的形成成正比，因此與SMase活性成正比。Amplite™Red使測定能夠以熒光強(qiáng)度或吸收模式讀取。該試劑盒是一種優(yōu)化的“混合閱讀"測定法，可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測Smase活性。我們開發(fā)了用于監(jiān)測酸性SMase活性的試劑盒13622。

1. 準(zhǔn)備SMase標(biāo)準(zhǔn)品和/或SMase測試樣品（50 µL）

2. 加入鞘磷脂工作溶液（50 µL）

3. 在37°C下孵育1-2小時(shí)

4. 加入鞘磷脂酶工作溶液（50 µL）

5. 在室溫下孵育1-2小時(shí)

6. 監(jiān)測Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）的熒光強(qiáng)度

重要說明
開始實(shí)驗(yàn)之前，在室溫下解凍每個(gè)試劑盒成分的小瓶（或瓶）。

儲備溶液的制備

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應(yīng)分為一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在-20°C下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。

1.鞘磷脂
酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 U / mL）：將20 µL含0.1％BSA的PBS加入鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（組分F）的小瓶中，制成10單位/ mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2. Amplite™Red儲備液（200X）：
將80 µL DMSO（組分G）加入小瓶Amplite™Red（組分C）中，制成200X Amplite™Red儲備液。遠(yuǎn)離光線。注意：Amplite™Red在存在硫醇（例如DTT）的情況下不穩(wěn)定。反應(yīng)中DTT的zui終濃度應(yīng)低于10 µM。Amplite™Red在高pH（> 8.5）時(shí)也不穩(wěn)定。反應(yīng)應(yīng)在pH 7-8下進(jìn)行。建議將pH 7.4用于測定緩沖液。

配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了方便起見，請使用我們的系列稀釋計(jì)

將1 µL 10單位/ mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)溶液添加到1000 µL測定緩沖液（組分E）中，以生成10 mU / mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（SMase7）。取10 mU / mL鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)溶液（SMase7）并進(jìn)行1：2連續(xù)稀釋，以得到連續(xù)稀釋的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)液（SMase6- SMase1）。 注意：稀釋的鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)溶液不穩(wěn)定。4小時(shí)內(nèi)使用。

準(zhǔn)備工作溶液

1.鞘磷脂工作溶液：
將50 µL鞘磷脂（組分B）添加到5 mL SMase反應(yīng)緩沖液（組分D）中，并充分混合以制成鞘磷脂工作溶液。注意：鞘磷脂工作溶液應(yīng)立即使用。

2.鞘磷脂
酶工作溶液：將5 mL測定緩沖液（組分E）添加到酶混合物（組分A）瓶中，并充分混合。然后，在開始測定之前，將25 µL 200X Amplite™Red儲備液加到酶混合液瓶中制成鞘磷脂酶工作液。 注意：  鞘磷脂酶工作溶液應(yīng)立即使用，并避免光照。較長的存儲時(shí)間可能會導(dǎo)致較高的測定背景。

程序

表1。鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品和測試樣品在黑色96孔微孔板中的布局。SMase =鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品（SMase1- SMase7，0.156至10 mU / mL），BL =空白對照，TS =測試樣品。

表2.   每個(gè)孔的試劑組成。

1. 根據(jù)表1和2中提供的布局，準(zhǔn)備鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品（SMase），空白對照（BL）和測試樣品（TS）。對于384孔板，每孔使用25 µL試劑代替50 µL。 注意：根據(jù)需要處理細(xì)胞或組織樣本。
   

2. 將50 µL鞘磷脂工作液添加到鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個(gè)孔中，以使鞘磷脂總測定體積為100 µL /孔。對于384孔板，將25 µL鞘磷脂工作溶液加到每個(gè)孔中，總體積為50 µL /孔。
   

3. 將反應(yīng)混合物在37°C下孵育1-2小時(shí)。
   

4. 在鞘磷脂酶標(biāo)準(zhǔn)品，空白對照和測試樣品的每個(gè)孔中加入50μL鞘磷脂酶工作溶液，使鞘磷脂酶的總測定體積為150μL/孔。對于384孔板，將25μL鞘磷脂酶工作溶液添加到每個(gè)孔中，總體積為75μL/孔。
   

5. 將反應(yīng)混合物在室溫下孵育1-2小時(shí)（避光）。
   

6. 使用熒光酶標(biāo)儀在Ex / Em = 540/590 nm（截止= 570 nm）處監(jiān)控?zé)晒獾脑黾印?/p>

數(shù)據(jù)分析

1e+4100010010.1- Dose-responseData legendGenerated with Quest Graph™Sphingomyelinase (mU/mL)RFUHover mouse to interact

從空白標(biāo)準(zhǔn)孔獲得的讀數(shù)（RFU）用作陰性對照。從其他標(biāo)準(zhǔn)的讀數(shù)中減去該值即可得到基線校正值。然后，繪制標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)，以獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線和方程式。該方程可用于計(jì)算鞘磷脂酶樣品。