在一些情況下，例如需要對真核微生物的代謝途徑進(jìn)行修飾，或者需要表達(dá)的真核生物蛋白需要合適的翻譯后修飾才具有生物活性時，就需要采用真核微生物表達(dá)載體。真核細(xì)胞基因表達(dá)調(diào)控要比原核細(xì)胞基因復(fù)雜得多，用于真核細(xì)胞的克隆和表達(dá)載體也不同于原核細(xì)胞。目前所用的真核載體大多是所謂的穿梭載體(shuttle—vector)。

    穿梭載體是指可以在不同宿主細(xì)胞中復(fù)制的載體，其中的一個宿主通常是大腸桿菌。這種載體必須既含有大腸桿菌或其質(zhì)粒的復(fù)制起點，又含有另一生物或其質(zhì)粒的復(fù)制起點。由于利用大腸桿菌進(jìn)行重組DNA技術(shù)的各種操作都zui為方便，因此通常先利用大腸桿菌體系構(gòu)建好所需的表達(dá)載體并大量復(fù)制后，再轉(zhuǎn)到其他細(xì)胞中去表達(dá)。

    用于真核生物基因表達(dá)的穿梭載體應(yīng)至少具備以下特征：①含有原核基因的復(fù)制起始序列以及篩選標(biāo)記，以便于在E．coli細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增和篩選；②含有真核基因的復(fù)制起始序列以及真核細(xì)胞篩選標(biāo)記；③含有有效的啟動子序列，保證其下游的外源基因能啟動有效的轉(zhuǎn)錄；④應(yīng)包含RNA聚合酶II所需的轉(zhuǎn)錄終止序列和poly A加入的信號序列；⑤具有合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點。值得注意的是，與原核宿主一載體系統(tǒng)常用的抗生素抗性標(biāo)記不同，真核宿主一載體系統(tǒng)所采用的選擇性標(biāo)記除了kanr基因(抗G418)等少數(shù)抗性標(biāo)記外，更常用的主要是營養(yǎng)缺陷型。例如，通常宿主為某一營養(yǎng)缺陷型(如ura3—52、his3一△ι、leu2一△ι、trpι一△ι和ιys2一201)，而載體上則攜帶相應(yīng)的基因(如URA3、HIS3、LEU2、TRPι和LYS2)。由于宿主在基本培養(yǎng)基上不能生長，而重組子能夠生長，因此可以用基本培養(yǎng)基來篩選重組子。

    目前研究得比較多的真核微生物表達(dá)體系之一是釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)。以釀酒酵母為宿主的常見載體有以下幾類。

(1)YEp載體YEp是酵母附加體質(zhì)粒(yeast episomal plasmid)的縮寫。附加體是指游離于染色體之外的獨立復(fù)制DNA分子。YEp載體由大腸桿菌質(zhì)粒、部分或全部酵母2μ質(zhì)粒以及酵母染色體的選擇標(biāo)記構(gòu)成。由于2μ質(zhì)粒內(nèi)含自主復(fù)制起點(ori)和使質(zhì)粒在酵母細(xì)胞中穩(wěn)定存在的STB區(qū)，所以這類載體在酵母細(xì)胞中獨立存在。

(2)YIp載體YIp是酵母整合型質(zhì)粒(yeast integrating plasmid)的縮寫。YIp載體由大腸桿菌質(zhì)粒和酵母的染色體DNA片段組成，可與宿主的染色體DNA同源重組，整合進(jìn)入宿主染色體中，從而隨宿主染色體一起復(fù)制。

(3)YAC載體YAC載體是酵母人工染色體(yeast artificial chromosome)的縮寫，是由酵母染色體中分離出來的DNA復(fù)制起始序列(ARS)、著絲點(CEN)、端粒()以及酵母選擇性標(biāo)記組成的能自我復(fù)制的線性克隆載體。YAC載體通?？梢砸噪p鏈環(huán)狀DNA的形式在大腸桿菌中復(fù)制，然后用限制酶消化成線性分子。多數(shù)YAC載體可以克隆250~400kb的外源DNA，在人類基因組計劃中發(fā)揮了重要作用。

    除釀酒酵母外，以巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、漢遜多形酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluueryomyces lactis)等為宿主的酵母表達(dá)系統(tǒng)也得到迅速發(fā)展并被廣泛應(yīng)用。