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測定意義：

FFA既是脂肪水解的產(chǎn)物，又是脂肪合成的底物。血清中FFA的濃度與脂類代謝、糖代謝、內分泌功能有關。

測定原理：

FFA與銅離子結合形成脂肪酸銅鹽，并溶于氯坊；利用銅試劑法測定銅離子含量，即可推算出游離脂肪酸含量。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、可調式移液槍、可見分光光度計/酶標儀、微量石英比色皿/96孔板、一個25 mL玻璃瓶、兩個10 mL玻璃瓶、正庚烷、無水甲醇、氯坊（三氯鉀烷）、無水乙醇和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1瓶，室溫保存。

試劑二：自備。實驗前1 d，加入4.8 mL正庚烷，0.2 mL無水甲醇，5 mL氯坊（自備），蓋緊后混勻，室溫保存。

試劑三：液體×1瓶，室溫保存。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前在試劑瓶中加入4 mL無水乙醇，充分溶解。

標準品：粉劑×1瓶，室溫保存。臨用前加入7.8 mL氯坊充分溶解，即為500μmol/L的棕櫚酸標準溶液。

樣品中FFA提取：

1、血液中FFA測定：將所取血液，室溫靜置1 h 后，于4 ℃ 離心機3 500 rpm離心15min，取上層血清置于-20℃冰箱保存，待測

2、組織中FFA含量測定：組織用生理鹽水沖洗干凈后，用吸水紙吸取表面水分，稱取約0.1g，加入1 mL試劑一，勻漿后，8000rpm，4℃離心10min，取上清液，稀釋5倍，待測。

測定：

1. 分光光度計預熱30 min以上，調節(jié)波長到550 nm，蒸餾水調零。

2. 空白管：取0.5mL EP管，加入10μL蒸餾水，100μL試劑二，40μL試劑三，40μL試劑四，蓋緊后充分震蕩混勻（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，靜置15min，于550nm光吸收，記為A空白管。

3. 標準管：取0.5mL EP管，加入10μL標準液，100μL試劑二，40μL試劑三，40μL試劑四，蓋緊后充分震蕩混勻（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，靜置15min，于550nm光吸收，記為A標準管。

4. 測定管：取0.5mL EP管，加入10μL上清液，100μL試劑二，40μL試劑三，40μL試劑四，蓋緊后充分震蕩混勻（2min），倒入微量石英比色皿/96孔板，靜置15min，于550nm光吸收，記為A測定管。

FFA含量計算：

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血液FFA含量

FFA含量（μ mol/L）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)] 1 L×5

=2500×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

2、組織FFA含量

（1）按樣本蛋白濃度計算

FFA含量（μ mol/g 鮮重）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V樣總÷Cpr ×5=2.5×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

FFA含量（μ mol/g 鮮重）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V樣總÷W×5=2.5×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W

C標準液：500μmol/L；1 L：指每升樣品；V樣總：上清液總體積，1 mL=0.001L；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g。

b.使用96孔板測定的計算公式如下

1、血液FFA含量

FFA含量（μ mol/L）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×1 L×5=2500×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

2、組織FFA含量

（1）按樣本蛋白濃度計算

FFA含量（μ mol/g 鮮重）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V樣總÷Cpr×5 =2.5×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

FFA含量（μ mol/g 鮮重）=[C標準液×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)]×V樣總÷W×5=2.5×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管) ÷W

C標準液：500μmol/L；1 L：指每升樣品；V樣總：上清液總體積，1 mL=0.001L；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品質量，g。

注意事項：

1. 試劑四配制應盡量晚配，可在操作到加入試劑三時，再配制試劑四。

2. 該試劑盒不可用塑料比色皿和96孔板測定，需用玻璃比色皿。