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測(cè)定意義：

β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、細(xì)菌和真菌等生物體，是催化木聚糖類半纖維素降解的關(guān)鍵酶，產(chǎn)物木糖可作為碳源應(yīng)用于微生物發(fā)酵。另外，β-木糖苷酶還可以作為生物漂白劑應(yīng)用于造紙工業(yè)，比傳統(tǒng)的漂白法環(huán)保，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

測(cè)定原理：

β-木糖苷酶催化對(duì)硝基苯酚-β-D-木糖苷產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚，對(duì)硝基苯酚在405nm處有特征吸收峰，測(cè)定405nm光吸收增加速率，可計(jì)算β-木糖苷酶活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑一：液體1mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑二：液體10mL×1瓶，4℃保存。

試劑三：液體10mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提?。?/span>

1. 植物樣本：稱取約0.1g樣品，加1mL提取液充分冰浴勻漿，然后12000rpm，4℃，離心20min，棄沉淀 ，取20μL上清測(cè)定蛋白含量，剩余上清作為待測(cè)酶液。
2. 細(xì)菌、真菌樣本：收集約500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，加入1mL提取液，超聲波破碎（冰浴，功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后10000rpm，4℃，離心10min，棄沉淀 ，取20μL上清測(cè)定蛋白含量，剩余上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作表：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405nm，對(duì)照管調(diào)零。
2. 操作表

β-木糖苷酶活性計(jì)算公式：

1. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=3.34x-0.001，R²=0.9991

（1）按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/ mg prot）=（A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷Cpr

= 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)，每克樣品1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/g 鮮重）= （A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷W

                           = 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)，每10⁴個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/10⁴ cell）=（A₄₀₅-0.001）÷3.34÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷細(xì)胞數(shù)量

= 0.5424×(A₄₀₅+0.001)÷細(xì)胞數(shù)量

ε：對(duì)硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，138mol/L/cm；d：比色皿光徑，1cm；T：反應(yīng)時(shí)間，20 min；稀釋倍數(shù)：V反總÷V樣=5；1000：1000mL=1L；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=1.67x-0.001，R²=0.9991

（1）按蛋白含量計(jì)算

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)，每毫克蛋白質(zhì)1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/ mg prot）=（A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷Cpr

= 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)，每克樣品1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/g 鮮重）= （A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷W

                           = 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

酶活定義：45℃，pH7.4時(shí)，每10⁴個(gè)細(xì)胞1min內(nèi)催化產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚的酶量為一個(gè)酶活單位。

β-木糖苷酶活性（U/10⁴cell）=（A₄₀₅-0.001）÷1.67÷T÷（ε×d）×稀釋倍數(shù)×1000 ÷細(xì)胞數(shù)量

= 2.1696×(A₄₀₅+0.001)÷細(xì)胞數(shù)量

ε：對(duì)硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)，138mol/L/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；T：反應(yīng)時(shí)間，20 min；稀釋倍數(shù)：V反總÷V樣=5；1000：1000mL=1L；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣品質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)。

注意事項(xiàng)：

1、吸光度變化應(yīng)該控制在0.05~0.8之間。否則加大樣品量或稀釋樣品，注意計(jì)算公式中參與計(jì)算的稀釋倍數(shù)要相應(yīng)改變。

2、樣品蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定，可選用考馬斯亮藍(lán)法蛋白含量測(cè)定試劑盒進(jìn)行測(cè)定。